Полиморфизм генов рецепторов врожденного иммунитета у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС

В современных исследованиях показана вовлеченность иммунных механизмов в патогенез перинатальных поражений ЦНС [1, 2]. Значительный интерес в связи с этим представляет функциональный полиморфизм генов рецепторов врожденного иммунитета (TLR) [3]. Генетически детерминированные различия сигнальных каскадов TLR приводят к увеличению продукции интерлейкинов и могут модифицировать иммунный ответ, способствовать апоптозу олигодендроцитов, дегенерации нейронов и прогрессированию заболевания [3].

Цель исследования — уточнить роль генного полиморфизма рецепторов врожденного иммунитета у детей с перинатальной гипоксически-ишемической энцефалопатией.

Материал и методы.
Обследованы 45 детей с гипоксически-ишемической энцефалопатией (ГИЭ), рожденных в ГБУ «Родильный дом» (г. Грозный) с гестационным возрастом ≥36 недель, весом ≥2000 г. У 32 детей диагностирована ГИЭ 2 ст., у 13 — ГИЭ 3 ст. Контрольную группу составили 50 здоровых новорожденных. Динамику психомоторного развития оценивали с помощью коэффициентов моторного развития — MQ (Motor quotient) и интеллектуального развития ребенка — DQ (Developmental quotient). Исход считали неблагоприятным в случае гибели ребенка, развития микро- или гидроцефалии, глухоты, слепоты, эпилепсии, детского церебрального паралича, задержки психомоторного развития с показателями DQ <75% и MQ <70%. 

Генотипирование SNP — TLR2 2258 G>A и TLR6745 С>Т проводили методом Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP analysis) в 96-луночном формате с использованием многоканального амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия) и диагностических тест-систем «SNP-экспресс» ООО НПФ «Литех» (Москва). Для разделения продуктов амплификации использовали метод горизонтального электрофореза в 3%-м агарозном геле, с электрофоретической детекцией («BioRadLaboratories», США). Для анализа межгрупповых различий применяли критерии χ². Степень риска развития неблагоприятного неврологического исхода оценивали по величине отношения шансов (OR). Статистически значимыми считали различия при p <0,05.

Результаты и их обсуждение.
Резидуальные исходы удалось оценить у 38 детей, трое детей умерли, четверо потеряны для наблюдения. Неблагоприятные неврологические последствия сформировались у 47,4% детей в виде задержки психомоторного и речевого развития (47,4%), гидроцефалии (7,9%), микроцефалии (2,6%), эписиндрома (13,6%), потери слуха (5,3%), зрения (2,6%), детского церебрального паралича (10,5%). 

При сравнении аллельных и генотипических частот TLR2 в зависимости от степени тяжести ГИЭ выявлено увеличение риска развития ГИЭ 3 ст. у резидентов мажорного аллеля 2258G (OR=2,17; 95% CI: 0,26–18,2, p=0,46) и носителей генотипа G2258G (OR=1,64; 95% CI: 0,18–14,9, p=0,66). Однако связь была статистически не значимой.

При анализе аллелей и генотипов TLR2 в зависимости от неврологических исходов установлена высокая распространенность мажорного аллеля 2258G (97,5% и 85,7%, p=0,049), низкая — минорного 2258A (2,5% и 14,3%, p=0,049) у детей с неблагоприятными неврологическими последствиями ГИЭ. Показатель отношения шансов для обладателей дикого аллеля составил OR=6,50, СI: 0,746–56,64. Установлено преобладание гомозиготного генотипа по дикому аллелю GG (92,3% и 71,4%, p=0,045), с увеличением риска развития неблагоприятного исхода более чем в 7 раз (OR=7,60, CI: 0,82–70,16). Носительство мутантного аллеля 2258A и гетерозиготного генотипа GА, напротив, ассоциировалось с низким риском неблагоприятного исхода.

Важно отметить, что микроглия имеет широкий репертуар TLR, при этом TLR2 экспрессируется наиболее интенсивно. Внутриклеточный цитозольный фрагмент TLR2 ответственен за включение адаптерного белка MyD88 и ядерного фактора транскрипции NF-kB, что приводит к увеличению синтеза IL1, IL2, IL6, IL8, IL10, TNFα и движению иммунных клеток в очаг повреждения [4].

При определении аллелей полиморфного гена TLR6 С745Т в локусе rs5743810 выявлено частотное преобладание аллеля 745Т (82,2% и 735) и генотипа Т745Т (68,9% и 54%) у детей с ГИЭ по сравнению с контролем. Однако различия оказались статистически не значимы.

Вероятность тяжелой формы ГИЭ возрастала у резидентов гомозиготного генотипа по минорному аллелю Т745Т (OR=4,60, CI: 0,82–70,16), частота встречаемости которого была существенно выше у детей с ГИЭ 3 ст. по сравнению со здоровыми детьми (84,6 и 54%, p=0,045). У младенцев с инвалидизирующими неврологическими последствиями ГИЭ редким оказался гетерозиготный генотип TLR6 C745T (10% и 38,7%, p=0,037). При этом частота гомозиготного варианта по рецессивному генотипу Т745Т была существенно выше (85% и 57,1%, p=0,049), что сопровождалось увеличением риска неблагоприятных исходов (OR=4,25; СI: 0,947–19,07).

Ранее установлено, что TLR6 участвует в усилении воспалительного ответа, связанного с повреждением ткани [5]. Генотип Ser/Ser уменьшает активацию фактора транскрипции NF-kB и синтез IL6 [6]. На моделях цереброваскулярных заболеваний показано, что TLR6 может способствовать воспалению и нейродегенерации с помощью лиганда CD36, образуя димерc TLR4, что связано с окислительным повреждением и геморрагическими расстройствами.

Таким образом, TLR2 и TLR6 являются клеточными «сенсорами», способными активироваться под действием продуктов распада, а их генетические вариации могут заметно влиять на продукцию провоспалительных цитокинов, а следовательно — на тяжесть и исход гипоксии-ишемии [5, 6, 7]. Полученные данные имеют предварительный характер, необходимы дальнейшие исследования в различных этнических группах для подтверждения роли данных SNP в развитии ГИЭ.

Заключение.
Полиморфизмы гена TLR2 G2258A (rs5743708) не влияют на развитие тяжелой формы гипоксически-ишемической энцефалопатии у новорожденных чеченской национальности. Фактором риска развития ГИЭ 3 ст. является гомозиготный по мутантному аллелю генотип TLR6 T745Т. Молекулярно-генетическими маркерами неблагоприятных неврологических исходов у детей с ГИЭ являются дикий аллель TLR2 2258G и гомозиготные по дикому (TLR2 G2258G) и мутантному (TLR6 T745Т) аллелям генотипы. К протективным маркерам относятся рецессивный аллель TLR2 2258А и гетерозиготный генотип TLR2 G2258A.

1. Boskabadi H, Moradi A, Zakerihamidi M. Interleukins in diagnosis of perinatal asphyxia: A systematic review. Int J Reprod Biomed (Yazd). 2018; 17(5): 303–314. https://doi.org/ 10.18502/ijrm.v17i5.4598

2. Xiong LL, Xue LL, Al-Hawwas M, Huang J, Niu RZ [et al.] Single-nucleotide polymorphism screening and RNA sequencing of key messenger RNAs associated with neonatal hypoxic-ischemia brain damage. Neural Regen Res. 2020; 15: 86–95. https://www.nrronline.org/text.asp?2020/15/1/86/264469

3. Mottahedin A, Svedin P, Nair S, Mohn CJ, Wang X. [et al.] Systemic activation of Toll-like receptor 2 suppresses mitochondrial respiration and exacerbates hypoxic-ischemic injury in the developing brain. J Cereb Blood Flow Metab. 2017; 37 (4): 1192–1198. https://doi.org/10.1177/0271678X17691292

4. El-Zayat SR, Sibaii H, Mannaa FA. Toll-like receptors activation, signaling, and targeting: an overview. Bull Natl Res Cent. 2019; 43: 187. https://doi.org/10.1186/s42269-019-0227-2

5. Fukui R, Murakami Y, Miyake K. New application of anti-TLR monoclonal antibodies: detection, inhibition and protection. Inflamm Regener. 2018; 38: 11. https://doi.org/10.1186/s41232-018-0068-7

6. Hamann L, Koch A, Sur S, Hoefer N, Glaeser C. [et al.] Association of a common TLR-6 polymorphism with coronary artery disease — implications for healthy ageing? Immun. Ageing. 2013; 10 (1): 43. https://doi.org/10.1186/1742-4933-10-43

7. Барычева ЛЮ, Идрисова АС, Кузьмина ЕС, Агранович ОВ. Клиническое значение провоспалительных интерлейкинов у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2021; 16 (3): 310–312. [Barycheva LYu, Idrisova AS, Kuzmina ES, Agranovich OV. Clinical significance of proinflammatory interleukins in newborns with hypoxic-ischemic CNS damage. Meditsinskiy vestnik Severnogo Kavkaza — Medical News of North Caucasus. 2021; 16 (3): 310–312. (In Russ)] https://doi.org/10.14300/mnnc.2021.16074

Barycheva LYu, Idrisova AS, Kuzmina ES, Mezhidov KS. Polymorphism of innate immunity receptor genes in newborns with hypoxic-ischemic brain damage. Allergology and Immunology in Pediatrics. 2022; 2: 33-35. (In Russ.) https://doi.org/10.53529/2500-1175-2022-2-33-35