Прогностическая значимость провоспалительных интерлейкинов у новорожденных с гипоксически-ишемической энцефалопатией

Введение.

Гипоксически-ишемическое поражение ЦНС является серьезной причиной перинатальной заболеваемости и смертности, а также неврологических нарушений у выживших детей [1, 2, 3, 4]. В современных исследованиях показана ведущая роль иммунной системы в патогенезе перинатальных поражений ЦНС [1, 2, 3, 4]. Развитие воспалительного ответа, инициированного гипоксически-ишемической травмой, характеризуется заметной активацией резидентных иммунных клеток, микроглии и периферических лейкоцитов, а также увеличением синтеза провоспалительных цитокинов, способствующих развитию деструктивных процессов в ЦНС [1, 4, 5].

Показано, что цитокины могут увеличивать и уменьшать степень ишемического повреждения головного мозга, определена нейродеструктивная роль ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18, ФНО-α [2, 6, 7]. Установлено, что показатели отдельных интерлейкинов положительно коррелируют со степенью тяжести гипоксически-ишемической энцефалопатии и могут использоваться в качестве ранних биомаркеров для диагностики церебральных повреждений у новорожденных высокого риска [8].

Цель: определить прогностическую ценность провоспалительных интерлейкинов у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС.

При выполнении исследования нами были поставлены вопросы:

1. Изменяется ли содержание провоспалительных интерлейкинов у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС?

2. Являются ли показатели ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-18 предикто6рами неблагоприятных неврологических исходов при гипоксически-ишемической энцефалопатии?

Материалы и методы исследования.

Проспективный когортный анализ цитокиновых профилей проведен у 45 детей, рожденных в ГБУ «Родильный дом» (г. Грозный) с признаками гипоксически-ишемического поражения ЦНС в 2019–2020 гг. Исследование одобрено локальным этическим комитетом. Получено информированное согласие от родителей. В исследование включены дети с умеренной и тяжелой гипоксически-ишемической энцефалопатией, гестационным возрастом ≥36 недель, весом ≥2000 г. Из исследования исключены новорожденные с признаками внутриутробной инфекции, генетически обусловленными заболеваниями, пороками развития, метаболическими нарушениями.

Диагноз гипоксически-ишемической энцефалопатии устанавливали при наличии не менее 3-х критериев: проявления дистресса плода (патологический характер сердцебиений, мекониальный характер околоплодных вод), потребность в респираторной поддержке методом ИВЛ в родильном зале не менее 5 минут, оценка по шкале Апгар 0–3 балла на 1-й минуте, показатели pH<7,1 и (или) BE<−16 — при первом анализе КОС в артериальной крови, клинические симптомы неонатальной энцефалопатии (судороги, нарушение мышечного тонуса, рефлексов, сознания), признаки полиорганной недостаточности [9]. Определение кислотно-основного состояния (дефицит буферных оснований BE, лактат, pH крови) выполняли на биохимическом анализаторе GEM Premier 3500 (Instrumentation Laboratory, США). В соответствии с клинической классификацией гипоксически-ишемической энцефалопатии (Sarnat H.B., Sarnat M.S., 1976) [10] в группу ГИЭ 2 ст. включены 32 ребенка, ГИЭ 3 ст. — 13. В контрольную группу вошли 50 здоровых новорожденных детей, обследованных в связи с физиологической желтухой, сопоставимых с больными детьми по массе тела и гестационному возрасту.

Дети наблюдались неврологом в неонатальном и младенческом периодах, в дальнейшем — в амбулаторно-поликлинических условиях и стационаре с периодичностью 1 раз в 1–3 месяца в зависимости от степени тяжести ГИЭ. Оценку неврологических исходов проводили в возрасте 18 месяцев на базе психоневрологического отделения ГБУ «РДКБ им. Е.П. Глинки» (Грозный). Динамику психомоторного развития оценивали с помощью коэффициентов моторного развития — MQ (Motor quotient) и интеллектуального развития ребенка — DQ (Developmental quotient) [9]. Из 45 новорожденных, включенных в исследование, резидуальные исходы удалось оценить у 38 детей. Трое детей умерли, четверо оказались недоступными для наблюдения. В зависимости от клинического исхода пациенты были разделены на группы: БИ — благоприятный исход, НИ — неблагоприятный неврологический исход или смерть. Под неблагоприятным неврологическим исходом понимали задержку психомоторного развития с показателями DQ <75%, MQ <70% развитие микро- или гидроцефалии, глухоты, слепоты, эпилепсии, детского церебрального паралича.

Количественное определение цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-17, ИЛ-10) в сыворотке крови выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем «Вектор-Бест» в соответствии с инструкцией производителя. Образцы крови собирали в течение 4–96 часов после рождения, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Супернатанты хранили при −20 °С. Исследование проводилось на базе ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора», научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций.

Статистический анализ результатов выполняли с помощью программ «Attestat 10.5.1», «Statistica SPSS», «Primer of Biostat 4,0». Количественные значения данных представляли в виде медианы и интерквантильного (25 и 75 процентили) размаха (Me (Q1-Q)). Для анализа межгрупповых различий применяли критерии Манна — Уитни, Ньюмена — Кейлса, Данна. Достоверность различий качественных признаков оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Степень риска развития неблагоприятного неврологического исхода оценивали по величине отношения шансов (OR). Диагностическую ценность признаков определяли их чувствительностью, специфичностью, положительной и отрицательной предсказательной ценностью. ROC-анализ использовали для определения концентрации интерлейкинов с оптимальной предикторной ценностью в отношении определенного клинического исхода. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

У новорожденных с тяжелыми и среднетяжелыми формами ГИЭ регистрировались статистически значимые изменения оценки по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, симптомы угнетения (93,3%), судороги (75,6%), брадикардия (40%), низкие показатели pH крови увеличение парциального давления углекислого газа, лактата, дефицит оснований.

Уровень летальности составил 6,3%. Неблагоприятные неврологические последствия к 18 месяцам формировались у 47,4% детей в виде задержки психомоторного и речевого развития (47,4%), гидроцефалии (7,9%), микроцефалии (2,6%), эписиндрома (13,6%), потери слуха (5,3%), зрения (2,6%), детского церебрального паралича (10,5%).

Установлено увеличение показателей ИЛ-1β у новорожденных с ГИЭ, более выраженное при тяжелой форме заболевания (рис. 1а) и неблагоприятных неврологических исходах (рис. 2а). Выявлены корреляционные взаимосвязи между уровнем ИЛ-1β и клинико-лабораторными показателями, такими как оценка по шкале Апгар на 5-й минуте (r_s=−0,31, p=0,01) и pH крови (r_s=−0,46, p=0,001).

Известно, что ИЛ-1β синтезируется активированными макрофагами и кератиноцитами, способствует экспрессии молекул адгезии, хемотаксису нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, стимулирует выработку других провоспалительных интерлейкинов — ИФ-ɤ, ИЛ-6, ФНО-α [11]. В исследовании Szpecht D. с соавт. показано увеличение сывороточного ИЛ-1β при церебральной ишемии с перивентрикулярной лейкомаляцией и внутрижелудочковыми кровоизлияниями [12]. Выявлено наличие взаимосвязи между высоким уровнем ИЛ-1β и неблагоприятными неврологическими исходами — формированием ДЦП [13, 14], вентрикуломегалии [15, 16], микроцефалии [13, 16], эписиндрома [17], нарушениями моторного, когнитивного, языкового и социального развития [13, 14, 15, 16], что совпадает с полученными нами данными.

При определении ИЛ-6 отмечено его увеличение в сыворотке крови как при ГИЭ 2, так и ГИЭ 3 ст. Наиболее высокие показатели определены у младенцев с ГИЭ 3 ст. — 72,7 [35,6; 93,4] пкг/л (рис. 1b). Выявлены корреляции между уровнем ИЛ-6 и оценкой по шкале Апгар на 5-й минуте (r_s=−0,44, p=0,002), pH крови (r_s=−0,65, p=0,001), дефицитом оснований BE (r_s=−0,47, p=0,001). Установлена зависимость между уровнем ИЛ-6 и неблагоприятным неврологическим исходом (рис. 2b).

Принято считать, что ИЛ-6 является ранним маркером воспаления, достигающим пиковых уровней уже через несколько часов после химического и механического повреждения тканей [6]. Существует мнение, что ИЛ-6 играет двоякую роль при гипоксически-ишемическом повреждении головного мозга, действуя как медиатор воспаления в острой фазе и как нейротрофический фактор в отдаленном периоде [2]. В ряде масштабных исследований показано увеличение ИЛ-6 в сыворотке крови у новорожденных с церебральной ишемией [2, 12]. Сообщалось о высоком уровне ИЛ-6 в спинномозговой жидкости, зависящем от степени тяжести ГИЭ и определяющим неврологические исходы [18]. Повышенные уровни ИЛ-6 предсказывали будущие когнитивные и моторные нарушения [13, 14, 15, 19], а также летальный исход. Однако в других исследованиях не подтверждено увеличение ИЛ-6 у детей с резидуальными последствиями ГИЭ в период новорожденности, что, вероятно, обусловлено его отсроченным увеличением после гипоксически-ишемической травмы [20].

Содержание ИЛ-8 возрастало в сыворотке крови у младенцев с ГИЭ. Однако статистически значимых отличий от контроля в группах ГИЭ 2 и ГИЭ 3 ст. зарегистрировано не было (рис. 1c). Не установлено корреляций значений ИЛ-8 с оценкой по шкале Апгар, показателями кислотно-основного обмена — pH, дефицитом оснований BE. Выявлено увеличение ИЛ-8 в группе детей с неблагоприятными неврологическими исходами — 13,50 [10,30; 4,80], p=0,03 (рис. 2с).

В экспериментальных исследованиях ранее доказана роль «хемотаксического» ИЛ-8 в повреждении головного мозга новорожденных [21]. Клинические результаты определения ИЛ-8 при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС не однозначны. В ряде исследований установлено увеличение ИЛ-8 у новорожденных с тяжелой церебральной ишемией и аномальными результатами нейровизуализации [19, 22]. Высокие уровни ИЛ-8 в сыворотке крови предлагаются в качестве предикторов неблагоприятного неврологического исхода, в том числе тяжелой эпилепсии [23], детского церебрального паралича [13, 14, 18], микроцефалии [13, 14, 16, 18], что не подтверждается другими авторами [24].

При определении ИЛ-18 в нашем исследовании отмечено его увеличение у детей с ГИЭ по сравнению с контролем, однако статистически значимых различий не установлено (рис. 1d). Выявлено повышение показателей у новорожденных с развитием неблагоприятных исходов (37,10 [23,45; 39,80], p=0,0008). Установлена корреляционная зависимость средней силы между уровнем ИЛ-18 и pH крови (r_s=−0,56, p=0,0001).

Известно, что ИЛ-18 синтезируется в астроцитах и клетках микроглии, потенцирует синтез ИЛ-2, ИЛ-1β и может опосредовать повреждение белого вещества головного мозга новорожденных [12, 21]. Высокие неонатальные уровни ИЛ-18 коррелируют с развитием детского церебрального паралича, постгеморрагической вентрикуломегалией, дефицитом интеллектуального и моторного развития [12, 25], что совпадает с полученными нами данными.

Диагностическую ценность интерлейкинов для прогнозирования неблагоприятного неврологического исхода определяли их чувствительностью, специфичностью, положительной и отрицательной предсказательной ценностью. При прогнозировании инвалидизирующих последствий ГИЭ установлена высокая предсказательная ценность только для ИЛ-1β и ИЛ-6, но не для ИЛ-8 и ИЛ-18.

Увеличение риска формирования неблагоприятного неврологического исхода определялось при увеличении ИЛ-1β более 19,4 пг/мл (OR=12,80; 95% CI: 2,90–56,58, AUC 0,86) и ИЛ-6 более 40,1 пг/мл (OR=11,33; 95% CI: 2,46–52,15, AUC 0,70). Уровни чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предсказательной ценности составили 85,0%, 76,2%, 80,0%, 76,0% и 66,7% 85,0%, 82,0%, 71,0% соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У новорожденных с гипоксически-ишемической энцефалопатией наблюдается увеличение ИЛ-1β и ИЛ-6 в сыворотке крови, зависящее от степени тяжести заболевания и коррелирующее с клинико-лабораторными показателями — оценкой по шкале Апгар, pH крови, дефицитом BE. Не установлено статистически значимых изменений сывороточных показателей ИЛ-8 и ИЛ-18.

У детей с неблагоприятными неврологическими исходами ГИЭ отмечаются высокие уровни ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18, определяемые в первые 4–96 часов после рождения. В качестве факторов риска формирования неблагоприятных инвалидизирующих последствий ГИЭ целесообразно использовать увеличение ИЛ-1β >19,4 пг/мл (OR=12,80; 95% CI: 2,90–56,58) и ИЛ-6 >40,1 пг/мл (OR=11,33; 95% CI: 2,46–52,15).

Список сокращений и терминов

AUС (Area under Curve) — площадь под ROC кривой
BE (Base excess) — дефицит оснований
DQ (Developmental quotient) — коэффициент интеллектуального развития
IL — интерлейкины
MQ (Motor quotient) — коэффициент моторного развития
OR (Oddis ratio) — анализ шансов
pH — водородный показатель, кислотность
ROC (Receiver operating characteristic) — анализ качества модели
БИ — благоприятный исход
ГИЭ — гипоксически-ишемическая энцефалопатия
ИЛ — интерлейкины
КОС — кислотно-основное состояние

1. Каркашадзе ГА, Аникин АВ, Зимина ЕП, Давыдова ИВ, Каримова Х.М. [и др.]. Современные данные о патогенезе и лечении гипоксически-ишемических поражений головного мозга у новорожденных. Педиатрическая фармакология. 2016; 13 (5): 452–467. [Karkashadze GA, Anikin AV, Zimina EP, Davydova IV, Karimova Kh.M. [i dr.]. Recent Information on the Pathogenesis and Treatment of Hypoxic-Ischemic Brain Lesions in Newborns. Pediatricheskaya farmakologiya. Pediatric pharmacology. 2016; 13(5): 452–467. (In Russ.)] https://doi.org/10.15690/pf.v13i5.1641

2. Boskabadi H, Moradi A, Zakerihamidi M. Interleukins in diagnosis of perinatal asphyxia: A systematic review. Int J Reprod Biomed (Yazd). 2018; 17(5): 303–314. https://doi.org/ 10.18502/ijrm.v17i5.4598.

3. Jiang LJ, Xu ZX, Wu MF, Dong GQ, Zhang LL [et al.]. Resatorvid protects against hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats. Neural Regen Res. 2020; 15(7): 1316–1325. https://doi.org/10.4103/1673-5374.272615.

4. Xiong LL, Xue LL, Al-Hawwas M, Huang J, Niu RZ [et al.]. Single-nucleotide polymorphism screening and RNA sequencing of key messenger RNAs associated with neonatal hypoxic-ischemia brain damage. Neural Regen Res; 2020; 15: 86–95. https://www.nrronline.org/text.asp?2020/15/1/86/264469

5. Chang Y, Kong R. Ganoderic acid A alleviates hypoxia-induced apoptosis, autophagy, and inflammation in rat neural stem cells through the PI3K/AKT/mTOR pathways. Phytother Res. 2019; 33: 1448–1456. https://doi.org/ 10.1002/ptr.6336

6. Orrock JE, Panchapakesan K, Vezina G, Chang T, Harris K [et al.]. Association of brain injury and neonatal cytokine response during therapeutic hypothermia in newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy. Pediatr Res. 2016; 79: 742–747.

7. Numis AL, Foster-Barber A, Deng X, Rogers EE, Barkovich A J [et al]. Early changes in pro-inflammatory cytokine levels in neonates with encephalopathy are associated with remote epilepsy. Pediatr Res. 2019; 86: 616–621. https://doi.org/ 10.1038/s41390-019-0473-x

8. Debillon T, Bednarek N, Ego A. LyTONEPAL: longterm outcome of neonatal hypoxic encephalopathy in the era of neuroprotective treatment with hypothermia: a French population-based cohort. BMC Pediatr. 2018; 18: 255. https://doi.org/10.1186/s12887-018-1232-6

9. Федеральное руководство по детской неврологии. Под редакцией профессора Гузевой ВИ. М: ООО «МК», 2016; 656 с. [Federal’noe rukovodstvo po detskoy nevrologii / Pod redaktsiey professora Guzevoy VI.Moscow: OOO «MK», 2016; 656 p. (In Russ.)].

10. Sarnat HB, Sarnat MS. Neonatal encephalopathy following fetal distress. A clinical and electroencephalographic study. Archives of Neurology. 1976; 33(10): 696–705.

11. Sadowska GB, Threlkeld SW, Flangini A, Sharma S, Stonestreet BS. Ontogeny and the effects of in utero brain ischemia on interleukin-1β and interleukin-6 protein expression in ovine cerebral cortex and white matter. Int J Dev Neurosci. 2012; 30(6): 457–463. https://doi.org/10.1016/j.ijdevneu.2012.06.001

12. Szpecht D, Gadzinowski J, Seremak-Mrozikiewicz A, Kurzawińska G, Drews K [et al]. The significance of polymorphisms in genes encoding Il-1β, Il-6, TNFα, and Il-1RN in the pathogenesis of intraventricular hemorrhage in preterm infants. Childs Nerv Syst. 2017; 33(11): 1905–1916. https://doi.org/10.1007/s00381-017-3458-2

13. Leviton A, Allred EN, Fichorova RN, Kuban KC, O’Shea TM [et al.]. Systemic inflammation on postnatal days 21 and 28 and indicators of brain dysfunction 2 years later among children born before the 28th week of gestation. Early Human Development, 2016; 93: 25–32. https://doi.org/10.1016/j.earlhumdev.2015.11.004

14. Berg JP van den, Westerbeek EA, Broring-Starre T, Garssen J, Elburg RM van. Neurodevelopment of preterm infants at 24 months after neonatal supplementation of a prebiotic mix: A randomized trial. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 2016; 63(2): 270–276. https://doi.org/10.1097/MPG.0000000000001148

15. Leviton A, Allred EN, Fichorova RN, O’Shea TM, Fordham LA [et al.]. Circulating biomarkers in extremely preterm infants associated with ultrasound indicators of brain damage. European Journal of Paediatric Neurology, 2018; 22: 440–450. https://doi.org/10.1016/j.ejpn.2018.01.018

16. Yanni D, Korzeniewski S, Allred EN, Fichorova RN, O’Shea TM [et al]. Both antenatal and postnatal inflammation contribute information about the risk of brain damage in extremely preterm newborns. Pediatric Research. 2017; 82, 691–696. https://doi.org/10.1038/pr.2017.128

17. Numis AL, Foster-Barber A, Deng X, Rogers EE, Barkovich AJ [et al]. Early changes in pro-inflammatory cytokine levels in neonates with encephalopathy are associated with remote epilepsy. Pediatr Res. 2019: 86(5): 616–621. https://doi.org/10.1038/s41390-019-0473-x

18. O’Hare FM, Watson RW, O’Neill A, Segurado R, Sweetman D [et al.]. Serial cytokine alterations and abnormal neuroimaging in newborn infants with encephalopathy. Acta Paediatr. 2017; 106(4): 561–567. https://doi.org/ 10.1111/apa.13745

19. Kuban KC, Joseph RM, O’Shea TM, Heeren T, Fichorova RN [et al.]. Circulating inflammatory-associated proteins in the first month of life and cognitive impairment at age 10 years in children born extremely preterm. Journal of Pediatrics. 2017; 180: 116–123.e111. https://doi.org/10.1016/j.jpeds.2016.09.054

20. Ahearne CE, Chang RY, Walsh BH, Boylan GB, Murray DM. Cord Blood IL-16 Is Associated with 3-Year Neurodevelopmental Outcomes in Perinatal Asphyxia and Hypoxic-Ischaemic Encephalopathy. Dev Neurosci 2017; 39: 59–65. https://doi.org/10.1159/000471508

21. McAdams RM, Juul SE. The role of cytokines and inflammatory cells in perinatal brain injury. Neurol Res Int. 2012; 2012: 561494. https://doi.org/10.1155/2012/561494

22. Zareen Z, Strickland T, Eneaney VM, Kelly LA, McDonald D [et al]. Cytokine dysregulation persists in childhood post Neonatal Encephalopathy. BMC Neurol. 2020; 20: 115. https://doi.org/10.1186/s12883-020-01656-w

23. Numis AL, Foster-Barber A, Deng X, Rogers EE, Barkovich AJ [et al.]. Early changes in pro-inflammatory cytokine levels in neonates with encephalopathy are associated with remote epilepsy. Pediatr Res. 2019; 86: 616–621. https://doi.org/10.1038/s41390-019-0473-x

24. Sweetman DU, Strickland T, Melo AM, Kelly LA, Onwuneme C [et al.]. Neonatal Encephalopathy Is Associated With Altered IL-8 and GM-CSF Which Correlates With Outcomes. Front Pediatr. 2021; 8: 556216. https://doi.org/10.3389/fped.2020.556216.

25. Šumanović-Glamuzina D., Jerković-Raguž M. Cytokines (IL-1 β, IL-6, IL-18, TNF-α) in Blood and Cerebrospinal Fluid in Neonatal Hypoxia/Ischemia). J Cell Immunol. 2020; 2(4): 183–187. https://www.scientificarchives.com/journal/journal-of-cellular-immunology

Barycheva LYu, Idrisova AS, Kuzmina ES, Agranovich OV, Mezhidov KS. Predictive significance of pro-inflammatory interleukins at newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy. Allergology and Immunology in Pediatrics. 2021;4:12–19. (In Russ.) https://doi.org/10.53529/2500-1175-2021-4-12-19